人畜共患线虫callipaeda感染家畜和野生动物的眼睛，并以犬科动物为主要宿主。它最初是在亚洲被描述的，但在过去的20年里，它在许多欧洲国家都有报道，主要是由果蝇传播的。本文报道了在奥地利发生的callipaeda及其病媒p.a variegata。从临床病例中采集线虫，用诱捕器、网和从一只狗的结膜囊中捕获果蝇。对果蝇和线虫进行了形态学鉴定，并分析了线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)的一个片段。计算DNA单倍型网络，可视化获得的COI序列与已发表序列的关系。此外，采用聚合酶链反应法对花椒属植物进行了DNA筛选。callipaeda和P. variegata分别在Burgenland、Lower Austria和Styria被鉴定。在维也纳也有记载，在意大利上奥地利州和南蒂罗尔也有记载。所有callipaeda均为1型单倍型。在果蝇中鉴定出22种不同的单倍型。其中一个序列与杂色花木的序列明显不同，与chi花木和okadai花木的序列关系更为密切。在所有植物标本中均未检出callipaeda。
callipaeda是一种螺旋体目的寄生线虫，影响各种哺乳动物的眼睛，由果蝇Phortica variegata传播。在家养动物中，狗(Canis lupus familiaris)经常受到感染，但猫(Felis silvestris catus)和兔(Oryctolagus cuniculus)也有感染的报道[1,2,3,4]。由于人类也可被感染，但频率较低，因此，毛足绦虫也是一种人畜共患线虫，因此对公共卫生具有重要意义[5,6]。在野生动物中，已在犬科、狐科、熊科、鼬科、原猴科、狐科和狐科中发现了callipaeda，它们代表了许多可能的潜在宿主[7,8,9,10,11,12]。
感染callipaeda的临床症状差异很大，可分为四个阶段，从无临床症状到角膜溃疡[3]。callipaeda通常在眼睑和眨眼膜下发现，很容易与其他影响眼睛的线虫区分开来，如盘尾丝虫lupi，它嵌入眼睛周围组织，通常与结节形成有关[13]。结合从眼睛中去除线虫，大环内酯，如莫西丁素和米霉素肟，对于预防感染和治疗都是有用的[14,15,16,17]。
由于其最初分布在亚洲，因此也被称为“东方眼虫”。在欧洲，已在大多数南部和中部国家发现了T. callipaeda，预计将在整个欧洲大陆进一步传播[18,19,20]。细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)的一个片段是常用的DNA条形码区域，该区域可用于T. callipaeda的分子鉴定和不同单倍型的区分。在T. callipaeda的欧洲种群中，仅检测到一种单倍型，而亚洲种群具有高度多样性，已知有20多种不同的单倍型[21,22]。
金毛蝇的有性繁殖发生在哺乳动物中，哺乳动物是最终宿主，而Phortica属的亲动物果蝇是中间宿主。雄性Phortica以泪液为食，在摄食过程中吞食T. callipaeda的一期幼虫[22]。在中间寄主中，幼虫可存活147天，发育为第三期幼虫，当果蝇下一次以泪液为食时，幼虫可传播给新的最终寄主[23]。
在欧洲，斑叶绦虫的主要媒介是斑叶绦虫，而在亚洲则是冈田绦虫[22]。在实验室条件下，老登白刺也是一种有能力的病媒，但其在野外条件下的病媒能力需要评估[24]。解剖法和聚合酶链反应法(PCR)可以检测白背蛾幼虫;然而，活体果蝇是通过解剖检测线虫的必要条件[25,26]。
为了收集斑叶蝇，捕蝇器可以手工制作，成本低，容易获得的组件。或者，在人或狗的眼睛周围放置网也可以用于此目的。虽然与捕蝇器相比，这是一种耗时且效率较低的方法，但使用这种方法可以收集到更多的雄性标本[27]。鉴定可以通过形态学特征或分析COI条形码区域来完成[28,29,30,31]。
欧洲大部分地区，特别是中欧，都有海拔600-1200米的山区，适合杂交种的栖息地。花椒果蝇主要在20 ~ 25℃活动，其食蚜活性随气温升高而增加[31,32]。
奥地利很少有斑叶绦虫的记录，但最近有报道callipaeda的本地感染[33,34,35,36]。在本研究开始时，仅有的少量斑蝇记录可追溯到1988年以前，目前尚不清楚这种果蝇在奥地利是否仍然是地方性的，如果是，分布有多广[35,36]。
在奥地利布尔根兰(Burgenland)发现斑叶虫(P. variegata)的第一篇报道是最近才发表的[37]，该地区尚未对斑叶虫及其载体P. variegata的遗传多样性进行调查。摘要本研究的目的是研究奥地利不同地区是否存在不同种类的斑叶瓢虫和异叶瓢虫，并评估它们的遗传多样性。在意大利与奥地利接壤的南蒂罗尔也调查了斑叶假蝇(P. variegata)和callipaeda的发生情况，以进一步了解这些种在意大利其他一些地区特有的物种的分布情况。
勃林格殷格翰公司(奥地利维也纳)数据库中所有同意接收客户邮件的兽医都收到了一份调查问卷，旨在确定私人兽医诊所中记录的callipaeda感染病例。该问卷可在2020年10月至11月期间在线完成。兽医有可能将他们以前收集的或从随后的临床病例中收集的斑点绦虫标本送到维也纳兽医大学寄生虫学研究所。纳入2015 - 2022年临床病例资料，并纳入已发表病例报告[34]。从以前去过国外的宠物身上收集的标本被排除在研究之外。
为了收集variegata，在森林、果树和遛狗区附近设置了用一次性塑料瓶制作的捕蝇器，rogero等[27]对此进行了详细描述。每2周从网中采集果蝇，在- 20°C冷冻以待分析，并更换切碎的水果作为诱饵。在2020年7月和8月，在四个地点的每个地点取样了两个陷阱。其中两个地点位于已报告有callipaeda感染的地区(施蒂里亚州Deutschlandsberg镇和下奥地利州G?nserndorf镇)，另外两个地点是在独立于已知病例的情况下选择的(维也纳Floridsdorf区和上奥地利州Rohr im Kremstal市)。2021年7月、8月和9月，在下奥地利州设置了18个陷阱，在上奥地利州设置了17个陷阱，在南蒂罗尔州设置了16个陷阱，在报告了callipaeda感染病例的参与兽医诊所以及其他志愿者提供的地点设置了11个陷阱(图1)。
图1
斑马虫采样点的地理分布和受感染动物的居住地，如果没有，本研究中包括的斑马虫临床病例的治疗兽医的诊所的地理分布。BL Burgenland, CA Carinthia, LA Lower Austria, SZ Salzburg, ST South Tyrol, SY Styria, TY Tyrol, UA Upper Austria, VI Vienna, VB Vorarlberg。[使用QGIS v.3.22.3 (Free Software Foundation, Boston, MA)创建的地图]
此外，从一只狗的眼睛中收集了8只果蝇，并用网捕获了3只果蝇。在与本研究同期进行的另一项研究[37]中发现的两种斑叶假单胞虫也被包括在内。
所有样本都在维也纳兽医大学寄生虫学研究所或巴里大学兽医系进行了形态鉴定。
采用QIAGEN公司的血液和组织试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany)，从斑叶假单胞菌(P. variegata)和callipaeda的整个标本中提取DNA。样品在56°C下孵育过夜，并根据制造商的方案进行处理。为了筛选不同品种p.a variegata样品中callipaeda DNA的存在，并对callipaeda样品进行遗传鉴定，分别使用引物COIintF/COIintR[38]和H14FilaCOIFw/H14FilaCOIRv[39]对线粒体COI片段649碱基对(bp)和674 bp片段进行pcr。利用引物Lep-F1/LepR1[40]和LCO1490/HCO2198[41]分别对COI基因665 bp和658 bp片段进行了DNA条形码鉴定。利用引物UEA7/UEA10定位COI基因的不同区域，进一步分析了一份与P. variegata基因不同的Phortica样品[42]。PCR产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳，用Midori Green Advance DNA染色剂(Nippon Genetics Europe，德国)染色。PCR阳性样本被送到一家商业公司(德国LGC Genomics)，使用PCR引物进行测序。
为了进行系统发育分析，使用BLAST功能从GenBank (National Center For Biotechnology Information)和Barcode of Life Data System (BoldSystems)数据库中获取的核苷酸序列，对每个生物使用一个序列进行检索。在GenBank中，将T. callipaeda序列指定为Thelazia (taxid 103826)，将P. variegata序列指定为Phortica (taxid 462262)，最大目标序列数设置为5000。对斑叶假单胞虫(P. variegata)来说，只包括了属于窄感假单胞虫(Phortica sensu stricto)的物种。使用快速傅里叶变换(MAFFT) v.7.311[43]进行多重比对时，使用默认选项(FFT-NS-2)对序列进行比对和排序，排除未覆盖本研究获得的序列片段的序列。所有具有明显测序错误和歧义特征的序列均从比对中剔除，排除在分析之外。
为了概述单倍型的多样性，基于比对计算了每种生物的最大似然和贝叶斯推断树，包括T. callipaeda的110个序列(617个核苷酸位置)(附加文件1)和P. variegata的280个序列(647个核苷酸位置)(附加文件2)。使用分子生物学和进化(DAMBE) v.7.0.5.1的数据分析将这些序列分解为单倍型[44]。剩下42个单倍型和188个单倍型。以鼠Mastophorus muris序列(GenBank登录号MK867476)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)序列(GenBank登录号MG753768)作为异斑按蚊的外类群。最大似然bootstrap共识树(1000个重复)使用W-IQ-TREE web服务器(http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/;[45])，根据修正后的赤池信息准则，对模型检验中的数据集提出了最适合的拟合模型，分别为对柽柳的TIM2 + F + I + G4和对花椒的TIM + F + I + G4。贝叶斯推理树的计算使用MrBayes v.3.2.7[46]，由于本程序中没有相同的模型，因此使用下一个复杂模型GTR+G+I。分析运行了106代(链数，4)，每千棵树采样一次。前25%的树作为老化树被丢弃，根据剩余的7500棵树计算50%的多数原则共识树。
基于共识树的结果，选择进化支用于使用Network 10.2.0.0 (Fluxus Technology, Suffolk, UK)计算中位连接单倍型网络，应用默认设置。网络出版商v.2.1.2.3 (Fluxus Technology)以图形方式编制了网络，并向网络提供了有关国家和主机的信息，最后由CorelDRAW 2021 (Corel，渥太华，安大略省)定稿。
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总共有183名兽医填写了问卷。其中，16名医生表示他们检测到了callipaeda，并指定宿主为布尔根兰(n=5)、下奥地利(n=1)、萨尔茨堡(n=1)、施蒂利亚(n=5)和维也纳(n=1)的狗(n=11)、猫(n=2)和马(n=1)。在克恩顿州的一匹马身上发现了callipaeda，这被认为是一种错误的鉴定，因为马从未被报道为callipaeda的宿主，而是泪马(Thelazia lacrymalis)的宿主[44,48]。2015-2022年共采集6只犬标本12份。犬在诊断前未出过国，来自施蒂里亚州(n=2)、下奥地利州(n=1)、维也纳(n=1)和布尔根兰(n=2)(图1)。
在调查的7个省中，有5个省检测到斑竹(n=45)(表1;图1)捕蝇器捕获32个标本;其中，17只雌性，8只雄性，7只身份不明(表1)。在布尔根兰的一只2岁雄性杜宾犬的眼睛中发现了8只果蝇(图1;表1)这只狗的两只眼睛都有眼液，这是在2周前开始的。用含有莫西丁素(2.5 mg/kg BW)和吡虫啉(10 mg/kg BW)的复方药物治疗。拜耳，勒沃库森，德国)以及含有妥布霉素和地塞米松的外用软膏(妥布霉素;诺华，巴塞尔，瑞士)。这只狗继续表现出眼液，并在一周后出现在手术中。进一步检查发现，两只眼睛的结膜囊中都有死果蝇。用棉签取蝇，眼液消失。
表1Phortica variegata本研究分析
本研究获得的序列上传到BoldSystems(工艺标识为PAVEA165-22-PAVEA176-22、PAVEA183-22、PAVEA184-23-PAVEA227-23)和GenBank(登录号为OP620892-OP620903、OQ507612、OQ359791-OQ359834和OQ689078)。
所有的T. callipaeda都对应于单倍型1，这是迄今为止在欧洲发现的唯一的单倍型(图2)。在果蝇中，43个序列可分配给P. variegata，共有22个不同的单倍型。在从一只狗的眼睛中提取的一只果蝇的情况下，不可能获得足够质量的序列，因此它被排除在系统发育分析之外。其中一个序列与P. variegata的序列不同，与以前在亚洲发现的物种(如Phortica chi和Phortica okadai)的序列更相似(图3)。使用COI基因的不同区域对该样本进行分析显示，与一个P. okadai (GenBank登录号EU431942)的相似性为99.67%，与另一个P. okadai (GenBank登录号:EF576924)，与Phortica variegata和Phortica semivirgo的相似性分别为93.46%和92.32% (GenBank登录号分别为MK659848和EF576935)。在所有植物标本中均未检出callipaeda。
图2
callipaeda细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)序列(617个核苷酸位置)的中位连接单倍型网络显示了地理分布(a)和报道的宿主(b)。圆圈代表单倍型;圆圈内的数字代表个体数量;如果没有数字显示，则只表示一个人。圆形旁边显示了具有代表性的单倍型GenBank加入编号;白色圆圈表示中间节点;连接单倍型的分支上的条形图表示替换的数量;星号表示本研究中获得的个体的单倍型
图3
与本研究未知标本(b)密切相关的Phortica variegata sensu stricto (a)和Phortica spp. COI序列(647个核苷酸位置)的中位连接单倍型网络显示了地理分布。圆圈代表单倍型;圆圈内的数字代表个体数量;如果没有数字显示，则只表示一个人。圆形旁边显示了具有代表性的单倍型GenBank加入编号;白色圆圈表示中间节点;连接单倍型的分支上的条形图表示替换的数量;星号表示本研究中获得的个体的单倍型
本研究在奥地利不同地区发现了callipaeda及其病媒斑叶虫(P. variegata)。虽然以前在布尔根兰、下奥地利、施蒂利亚和维也纳都有报道[35,36,37]，但在上奥地利是首次发现。在本研究中，我们发现了异斑蝶和callipaeda分布的新区域，但由于奥地利并非所有省份都进行了采样，并且诱捕器的位置是基于假定的宿主物种栖息地的适宜性，而不是根据系统的网格，因此无法无缝地绘制奥地利寄生虫的存在和不存在。
雌斑田鼠主要在捕蝇器中捕获，雄斑田鼠主要在犬眼周围捕获。雄性斑田鼠对眼睛的偏好并不意外，这在其他研究中也有观察到，并且只有雄性斑田鼠被认为是callipaeda的载体[25,27,49]。据我们所知，到目前为止，还没有报道过狗结膜囊中有斑斑伪蝇引起的临床症状。这可能是获得的果蝇在进食泪液时被捕获在眼睛里。
正如预期的那样，在奥地利只发现了T. callipaeda单倍型1，这是迄今为止在欧洲检测到的唯一单倍型。相比之下，亚洲有很高的单倍型多样性[21,50]。据推测，T. callipaeda不是原产于欧洲，它传入欧洲是一个单一的事件。这一假设也得到了以下事实的支持:1989年意大利首次报道了T. callipaeda，之后由于P. variegata作为中间宿主的存在，它传播到其他欧洲国家[25,51,52,53]。
在欧洲和亚洲，虽然在欧洲也有一些野生动物被报道为宿主，但在狗身上常见于犬类。自从首次报道这种寄生虫在欧洲出现以来，人们对它的兴趣增加了，有关它在新宿主中出现的报道可能部分是由于研究工作的增加。最近的报告表明，亚洲的野生动物很可能也经常被感染[10,11]。尽管在欧洲有人类感染T. callipaeda的病例报告，但这些病例在亚洲更为常见。欧洲动物的感染率可能还没有高到足以导致许多人类病例。然而，如果这种寄生虫在欧洲变得更加普遍，这种情况将来可能会改变[3,18]。由于本研究中报告的临床病例数较少，以及调查的Phortica果蝇均未检测出该寄生虫，因此奥地利目前的callipaeda流行率可能较低。
在COI条形码区，许多种在P. variegata复合体中不是单系的。然而，在先前的研究[54]和本研究中，P. variegata sensu stricto都被证明是单系的。在美国已经发现了2个单倍型，在欧洲发现了23个不同的单倍型，其中本研究发现了20个新单倍型。在奥地利发现的单倍型的多样性可归因于这种果蝇长期以来一直是欧洲本土[35]。
与斑叶假蝇不同的COI条形码序列与欧洲尚未报道的chi和okadai假蝇的COI条形码序列更为接近。后两个物种不是单系的，也不是与它们密切相关的形态种或隐种明显分开的，因此通过使用COI基因来描述它们是有限的[54,55]。Phortica chi和P. okadai仅在亚洲报道，但P. semivirgo是P. variegata复合体的另一种，在欧洲被发现[29,56,57]。由于在分析时没有COI条形码区域的参考序列，因此对COI基因的另一个区域进行了额外的分析，以确定样品是否可能来自半处女草标本。虽然该序列与报道的P. okadai序列(GenBank登录号EU431942)相似度为99.67%，但与报道的P. semivirgo序列(GenBank登录号EF576935)不密切相关，与比较欧洲Phortica种的系统发育研究中使用的P. okadai序列(GenBank登录号EF576924)相似度仅为92.16%[29]。
线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)的贝叶斯干扰树(BI);节点用BI后验概率和最大似然自举值标记。用红色标记的分支用于计算包含本研究中获得的序列的中位连接单倍型(hpt)网络。比例尺表示根据所采用的序列进化模型，期望每个位点的平均替换数。
以Phortica senu stricto的COI(647个核苷酸位置)序列为特征的BI树。节点用BI后验概率和最大似然自举值标记。用红色标记的分支用于计算包含本研究中获得的序列的中位连接hpt网络。比例尺表示根据所采用的序列进化模型，期望每个位点的平均替换数。
需要利用额外的遗传标记对Phortica spp.进行进一步分析，以阐明本研究中发现的新序列的意义，并评估其在欧洲其他地区的发生情况。callipaeda及其媒介斑叶虫(P. variegata)可被认为是奥地利的地方病。
下载原文档：https://link.springer.com/content/pdf/10.1186/s13071-023-05913-y.pdf
